本发明公开了一种非对称近红外方酸染料及其制备方法与应用，是将间氨基苯酚衍生物和方酸混合，溶于适当溶剂中，并在氮气保护下回流分水处理；然后将所得反应混合物冷却至室温，减压除去溶剂，所得粗产品用二氯甲烷洗涤后经硅胶柱层析纯化，得所述非对称近红外方酸染料。本发明通过氧醚链的引入可有效提高方酸染料在水溶液中的溶解性，所得非对称近红外方酸染料稳定性好，光学性能优异，可作为荧光和比色双响应的蛋白标记物，用于生物分子标记、分析和分离等多个领域。