本发明涉及一种含N-非取代葡萄糖胺(GlcNH3+)肝素六糖的制备及其纯化。所述方法是以酶解低分子量肝素为原料，通过凝胶色谱和离子交换高效液相色谱等方法分离提纯肝素钠六糖；利用阳离子交换树脂和吡啶中和法制备肝素吡啶六糖；最后用脱N-硫酸化法制备含不同GlcNH3+数目的肝素六糖，并用SAX-HPLC等方法进行分离提纯。本方法可特异性制备出含不同GlcNH3+数目和序列的系列肝素寡糖，为硫酸类肝素中GlcNH3+残基的结构与功能及其与疾病关系的研究提供重要的糖库。